Metoda comet assay se používá při hodnocení poškození molekul DNA v živých buňkách a díky tomu může být využita i k hodnocení vlivu léčiv a nových lékových forem na poškození DNA především u eukaryotních buněk. Principem metody je migrace a separace řetězců DNA v elektrickém poli v závislosti na jejich délce - tedy míře poškození. Analýza je prováděna na celých buňkách po narušení jejich membrány. Tímto způsobem je v okolí buňky, která tvoří tzv. hlavu komety, tvořen poškozenou DNA tzv. ohon (ocas) komety. Jedním z klíčových parametrů pro úspěšný průběh analýzy je schopnost lyzačního pufru narušit buněčnou membránu. Cílem této bakalářské práce bylo srovnat vhodnost tří typů lyzačního pufru a vliv jeho složení na rozměr komet. Analýza byla provedena na savčích buňkách - myších fibroblastech 3T3. Poškození DNA bylo způsobeno expozicí roztoku peroxidu vodíku. Následně byl zkoumán rozměr ohonu komety. Tedy do jaké míry jsou jednotlivé lyzační pufry schopny narušovat buněčnou membránu v závislosti na jejich složení.
Anotace v angličtině
The comet assay method is used in evaluation of damage to DNA molecules in living cells and can therefore also be used to assess the effect of drugs and new dosage forms on DNA damage, especially in eukaryotic cells. The principle of the method is migration and separation of DNA chains in an electric field depending on their length - i.e. the level of damage. The analysis is performed on whole cells after disruption of their membrane. In this way, the tail of the comet is formed by damaged DNA in the surroundings of the cell, which forms the so-called head of the comet. One of the key parameters for a successful analysis is the ability of the lysis buffer to disrupt the cell membrane. The aim of this bachelor thesis was to compare suitability of three types of lysis buffer and influence of its composition on the size of the comets. The analysis was conducted on mammalian cells - mouse fibroblasts 3T3. DNA damage was caused by exposure to hydrogen peroxide solution. Afterwards, the size of the comet tail was investigated. Thus, the extent to which the individual lysis buffers are able to disrupt the cell membrane depending on their composition was explored.
Klíčová slova
comet assay, poškození DNA, lyzační pufr
Klíčová slova v angličtině
comet assay, DNA damage, lysis buffer
Rozsah průvodní práce
61 s. (76 910 znaků bez mezer)
Jazyk
CZ
Anotace
Metoda comet assay se používá při hodnocení poškození molekul DNA v živých buňkách a díky tomu může být využita i k hodnocení vlivu léčiv a nových lékových forem na poškození DNA především u eukaryotních buněk. Principem metody je migrace a separace řetězců DNA v elektrickém poli v závislosti na jejich délce - tedy míře poškození. Analýza je prováděna na celých buňkách po narušení jejich membrány. Tímto způsobem je v okolí buňky, která tvoří tzv. hlavu komety, tvořen poškozenou DNA tzv. ohon (ocas) komety. Jedním z klíčových parametrů pro úspěšný průběh analýzy je schopnost lyzačního pufru narušit buněčnou membránu. Cílem této bakalářské práce bylo srovnat vhodnost tří typů lyzačního pufru a vliv jeho složení na rozměr komet. Analýza byla provedena na savčích buňkách - myších fibroblastech 3T3. Poškození DNA bylo způsobeno expozicí roztoku peroxidu vodíku. Následně byl zkoumán rozměr ohonu komety. Tedy do jaké míry jsou jednotlivé lyzační pufry schopny narušovat buněčnou membránu v závislosti na jejich složení.
Anotace v angličtině
The comet assay method is used in evaluation of damage to DNA molecules in living cells and can therefore also be used to assess the effect of drugs and new dosage forms on DNA damage, especially in eukaryotic cells. The principle of the method is migration and separation of DNA chains in an electric field depending on their length - i.e. the level of damage. The analysis is performed on whole cells after disruption of their membrane. In this way, the tail of the comet is formed by damaged DNA in the surroundings of the cell, which forms the so-called head of the comet. One of the key parameters for a successful analysis is the ability of the lysis buffer to disrupt the cell membrane. The aim of this bachelor thesis was to compare suitability of three types of lysis buffer and influence of its composition on the size of the comets. The analysis was conducted on mammalian cells - mouse fibroblasts 3T3. DNA damage was caused by exposure to hydrogen peroxide solution. Afterwards, the size of the comet tail was investigated. Thus, the extent to which the individual lysis buffers are able to disrupt the cell membrane depending on their composition was explored.
Klíčová slova
comet assay, poškození DNA, lyzační pufr
Klíčová slova v angličtině
comet assay, DNA damage, lysis buffer
Zásady pro vypracování
Cíle práce:
1. Seznámit se s metodami hodnocení poškození DNA eukaryotických buněk.
2. Seznámit se s principem a variantami metody comet assay (kometové analýzy) na savčích buňkách.
3. Provést literární rešerši týkající se využití metody comet assay při hodnocení léčiv a nových lékových forem.
4. Navrhnout optimalizaci lyzačního kroku metody.
5. Provést hodnocení optimalizované metody.
Teoretická východiska (včetně výstupu z kvalifikační práce):
Metoda comet assay je jednou z metod, která poskytuje informaci o možném poškození DNA. Jedná se o elektroforetickou metodu založenou na odlišné rychlosti migrace různě velikých fragmentů DNA v gelu. Proces je ovlivňován řadou proměnných včetně podmínek lýzy buněk. Výstupem práce bude volba optimálních podmínek na základě literárního průzkumu a empirického ověření.
Výzkumné předpoklady / výzkumné otázky:
Pro správné fungování a dosažení správných a relevantních výsledků je nutné optimální nastavení metody. V případě metody comet assay se jedná zejména o zpracování vzorků a jejich zalití do gelu a také použitý lyzační pufr. Výzkumnou otázkou této BP je právě, jaký lyzační pufr je optimální pro zpracování savčích buněk metodou comet assay, jak jeho složení ovlivňuje délku "ocasu komety".
Metoda:
Kvantitativní.
Technika práce, vyhodnocení dat:
Savčí buňky 3T3 budou zality do gelu a zpracovány metodou comet assay. Následně bude provedeno barvení DNA. Bude pořízena obrazová dokumentace a vyhodnocena obrazovou analýzou. Pro každou testovací skupinu bude naměřená délka ocasu ze statisticky významného počtu buněk. Naměřená data budou statisticky vyhodnocena. Hodnocena bude střední hodnota délky, směrodatná odchylka a další. Výsledky budou staticky zpracovány a porovnány.
Místo a čas realizace výzkumu:
Experimentální část BP bude realizována na Ústavu pro nanomateriály, nové technologie a inovace TUL po domluvě se školitelkou/ konzultantkou v časové době od listopadu 2022 – do března 2023.
Vzorek:
U každého testovaného vzorku (lyzačního pufru) bude nasnímáno a měřeno minimálně 50 buněk.
Rozsah práce:
Rozsah bakalářské práce činí 50–70 stran (tzn. 1/3 teoretická část, 2/3 výzkumná část).
Forma zpracování kvalifikační práce:
Tištěná a elektronická.
Zásady pro vypracování
Cíle práce:
1. Seznámit se s metodami hodnocení poškození DNA eukaryotických buněk.
2. Seznámit se s principem a variantami metody comet assay (kometové analýzy) na savčích buňkách.
3. Provést literární rešerši týkající se využití metody comet assay při hodnocení léčiv a nových lékových forem.
4. Navrhnout optimalizaci lyzačního kroku metody.
5. Provést hodnocení optimalizované metody.
Teoretická východiska (včetně výstupu z kvalifikační práce):
Metoda comet assay je jednou z metod, která poskytuje informaci o možném poškození DNA. Jedná se o elektroforetickou metodu založenou na odlišné rychlosti migrace různě velikých fragmentů DNA v gelu. Proces je ovlivňován řadou proměnných včetně podmínek lýzy buněk. Výstupem práce bude volba optimálních podmínek na základě literárního průzkumu a empirického ověření.
Výzkumné předpoklady / výzkumné otázky:
Pro správné fungování a dosažení správných a relevantních výsledků je nutné optimální nastavení metody. V případě metody comet assay se jedná zejména o zpracování vzorků a jejich zalití do gelu a také použitý lyzační pufr. Výzkumnou otázkou této BP je právě, jaký lyzační pufr je optimální pro zpracování savčích buněk metodou comet assay, jak jeho složení ovlivňuje délku "ocasu komety".
Metoda:
Kvantitativní.
Technika práce, vyhodnocení dat:
Savčí buňky 3T3 budou zality do gelu a zpracovány metodou comet assay. Následně bude provedeno barvení DNA. Bude pořízena obrazová dokumentace a vyhodnocena obrazovou analýzou. Pro každou testovací skupinu bude naměřená délka ocasu ze statisticky významného počtu buněk. Naměřená data budou statisticky vyhodnocena. Hodnocena bude střední hodnota délky, směrodatná odchylka a další. Výsledky budou staticky zpracovány a porovnány.
Místo a čas realizace výzkumu:
Experimentální část BP bude realizována na Ústavu pro nanomateriály, nové technologie a inovace TUL po domluvě se školitelkou/ konzultantkou v časové době od listopadu 2022 – do března 2023.
Vzorek:
U každého testovaného vzorku (lyzačního pufru) bude nasnímáno a měřeno minimálně 50 buněk.
Rozsah práce:
Rozsah bakalářské práce činí 50–70 stran (tzn. 1/3 teoretická část, 2/3 výzkumná část).
Forma zpracování kvalifikační práce:
Tištěná a elektronická.
Seznam doporučené literatury
VYCHODILOVÁ, Leona et al. 2019. Klinická genetika. 1. vyd. Brno: Veterinární a farmaceutická univerzita Brno. ISBN 978-80-7305-825-8.
MURRAY, Robert K. a Victor W. RODWELL. 2012. Harperova ilustrovaná biochemie. 5. české vyd. Praha: Galén. ISBN 978-80-72-62-907-7.
NOVOTNÁ, Božena et al. 2001. Kometový test: Princip metody a klinické aplikace. Časopis lékařů českých. 140 (24), s. 761 - 766. ISSN 0008-7335. Dostupné z: https://www.prolekare.cz/casopisy/casopis-lekaru-ceskych/2001-24/kometovy-test-princip-metody-a-klinicke-aplikace-25794
DVOŘÁK, Miroslav a Alena MATĚJOVIČOVÁ. 2008. Principy a využití kometové analýzy při detekci poškození DNA. Chemické listy. 102 (11), s. 977 - 983. ISSN 0009-2770. Dostupné z: http://www.chemicke-listy.cz/docs/full/2008_11_977-983.pdf
OECD/OCDE 489. 2016. OECD guidline for the testing of chemicals- Section 4: In vivo mammalian alkaline comet assay. 1. vyd. Paříž: OECD Publishing.
OTOVÁ, Berta et al. 2022. Lékařská biologie a genetika (I. díl). 3. vyd. Praha: Karolinum. ISBN 978-80-246-5221-4.
KOHOUTOVÁ, Milada et al. 2017. Lékařská biologie a genetika (II. díl). 2. vyd. Praha: Karolinum. ISBN 978-80-246-3790-7.
PANCZAK, Aleš et al. 2013. Lékařská biologie a genetika (III. díl). 1. vyd. Praha: Karolinum. ISBN 978-80-246-2423-5.
DVOŘÁK, Miroslav. 2014. Hodnocení kometové analýzy s počítačovou podporou – opakovatelnost a reprodukovatelnost dat. Chemické Listy. 108 (12), s. 1149 - 1152. ISSN 0009-2770. Dostupné z: http://www.chemicke-listy.cz/ojs3/index.php/chemicke-listy/article/view/425
NOVOTNÁ, Božena. et al. 2016. Naše první zkušenosti s využitím kometového testu při hodnocení integrity DNA ve spermiích. Česká urologie. 20 (4), s. 317 - 325. ISSN 2336-5692. Dostupné z: https://www.czechurol.cz/pdfs/cur/2016/04/09.pdf
COLLINS, Andrew R. 2004. The comet assay for DNA damage and repair: Principles, applications, and limitations. Molecular Biotechnology. 26, s. 249 - 261. ISSN 1559-0305. Dostupné z: https://link.springer.com/article/10.1385/MB:26:3:249
MRAČKOVÁ, Gabriela et al. 1999. Využití "comet assay" při hodnocení profesionální expozice pracovníků v koksárnách. Pracovní lékařství. 1, s. 3 - 8. ISSN 0032-6291. Dostupné z: https://www.prolekare.cz/casopisy/pracovni-lekarstvi/1999-1/vyuziti-comet-assay-pri-hodnoceni-profesionalni-expozicepracovniku-v-koksarnach-29502
BANGRYANTSEVA, Yana. 2015. Využití kometového testu při měření integrity DNA v klinice a v aplikovaném výzkumu. Praha. Disertační práce. Univerzita Karlova v Praze, Přírodovědecká fakulta, Katedra genetiky a mikrobiologie. Dostupné z: https://dspace.cuni.cz/handle/20.500.11956/80399
BAJPAYEE, Mahima et al. 2016. Chapter 1:The Comet Assay: A Versatile Tool for Assessing DNA Damage, In: BAJPAYEE, Mahima et al. The Comet Assay in Toxicology. 2. vyd. Cambridge: The Royal Society of Chemistry, s. 1 - 64. eISBN 978-1-78262-289-5.
LU, Yanxin et al. 2017. Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay. Journal of Visualized Experiments. 128, e56450. DOI: 10.3791/56450. Dostupné z: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5752397/
GAJSKI, Goran et al. 2019. The comet assay in animal models: From bugs to whales. Mutation Research/Reviews in Mutation Research. 779, s. 82-113. DOI: 10.1016/j.mrrev.2019.02.003. Dostupné z: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1383574218300589
Seznam doporučené literatury
VYCHODILOVÁ, Leona et al. 2019. Klinická genetika. 1. vyd. Brno: Veterinární a farmaceutická univerzita Brno. ISBN 978-80-7305-825-8.
MURRAY, Robert K. a Victor W. RODWELL. 2012. Harperova ilustrovaná biochemie. 5. české vyd. Praha: Galén. ISBN 978-80-72-62-907-7.
NOVOTNÁ, Božena et al. 2001. Kometový test: Princip metody a klinické aplikace. Časopis lékařů českých. 140 (24), s. 761 - 766. ISSN 0008-7335. Dostupné z: https://www.prolekare.cz/casopisy/casopis-lekaru-ceskych/2001-24/kometovy-test-princip-metody-a-klinicke-aplikace-25794
DVOŘÁK, Miroslav a Alena MATĚJOVIČOVÁ. 2008. Principy a využití kometové analýzy při detekci poškození DNA. Chemické listy. 102 (11), s. 977 - 983. ISSN 0009-2770. Dostupné z: http://www.chemicke-listy.cz/docs/full/2008_11_977-983.pdf
OECD/OCDE 489. 2016. OECD guidline for the testing of chemicals- Section 4: In vivo mammalian alkaline comet assay. 1. vyd. Paříž: OECD Publishing.
OTOVÁ, Berta et al. 2022. Lékařská biologie a genetika (I. díl). 3. vyd. Praha: Karolinum. ISBN 978-80-246-5221-4.
KOHOUTOVÁ, Milada et al. 2017. Lékařská biologie a genetika (II. díl). 2. vyd. Praha: Karolinum. ISBN 978-80-246-3790-7.
PANCZAK, Aleš et al. 2013. Lékařská biologie a genetika (III. díl). 1. vyd. Praha: Karolinum. ISBN 978-80-246-2423-5.
DVOŘÁK, Miroslav. 2014. Hodnocení kometové analýzy s počítačovou podporou – opakovatelnost a reprodukovatelnost dat. Chemické Listy. 108 (12), s. 1149 - 1152. ISSN 0009-2770. Dostupné z: http://www.chemicke-listy.cz/ojs3/index.php/chemicke-listy/article/view/425
NOVOTNÁ, Božena. et al. 2016. Naše první zkušenosti s využitím kometového testu při hodnocení integrity DNA ve spermiích. Česká urologie. 20 (4), s. 317 - 325. ISSN 2336-5692. Dostupné z: https://www.czechurol.cz/pdfs/cur/2016/04/09.pdf
COLLINS, Andrew R. 2004. The comet assay for DNA damage and repair: Principles, applications, and limitations. Molecular Biotechnology. 26, s. 249 - 261. ISSN 1559-0305. Dostupné z: https://link.springer.com/article/10.1385/MB:26:3:249
MRAČKOVÁ, Gabriela et al. 1999. Využití "comet assay" při hodnocení profesionální expozice pracovníků v koksárnách. Pracovní lékařství. 1, s. 3 - 8. ISSN 0032-6291. Dostupné z: https://www.prolekare.cz/casopisy/pracovni-lekarstvi/1999-1/vyuziti-comet-assay-pri-hodnoceni-profesionalni-expozicepracovniku-v-koksarnach-29502
BANGRYANTSEVA, Yana. 2015. Využití kometového testu při měření integrity DNA v klinice a v aplikovaném výzkumu. Praha. Disertační práce. Univerzita Karlova v Praze, Přírodovědecká fakulta, Katedra genetiky a mikrobiologie. Dostupné z: https://dspace.cuni.cz/handle/20.500.11956/80399
BAJPAYEE, Mahima et al. 2016. Chapter 1:The Comet Assay: A Versatile Tool for Assessing DNA Damage, In: BAJPAYEE, Mahima et al. The Comet Assay in Toxicology. 2. vyd. Cambridge: The Royal Society of Chemistry, s. 1 - 64. eISBN 978-1-78262-289-5.
LU, Yanxin et al. 2017. Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay. Journal of Visualized Experiments. 128, e56450. DOI: 10.3791/56450. Dostupné z: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5752397/
GAJSKI, Goran et al. 2019. The comet assay in animal models: From bugs to whales. Mutation Research/Reviews in Mutation Research. 779, s. 82-113. DOI: 10.1016/j.mrrev.2019.02.003. Dostupné z: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1383574218300589
Přílohy volně vložené
Žádné přílohy
Přílohy vázané v práci
grafy, schémata
Převzato z knihovny
Ano
Plný text práce
Přílohy
Posudek(y) oponenta
Hodnocení vedoucího
Záznam průběhu obhajoby
Průběh obhajoby je zveřejněn pouze přihlášenému uživateli.